原代细胞复苏交互式SOP

1. 准备工作 (Preparation)

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将足量的RPMI-1640完全培养基 (含10% FBS) 和基础培养基 (含1% FBS) 在37℃水浴锅中预热。

确认冻存管中的细胞类型及数量，准备好相应数量的50 mL无菌离心管。

准备好移液管、移液器，并清洁生物安全柜。

2. 细胞复苏与稀释 (Thawing & Dilution)

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2.1 快速解冻

从液氮罐中迅速取出细胞冻存管，立即置于37℃水浴锅中快速晃动解冻 (约1-2分钟)。

在仅剩一小块冰芯时终止水浴，用75%酒精消毒外部，转移至生物安全柜。

将细胞悬液小心转移至50 mL无菌离心管中。

2.2 逐步稀释DMSO

边晃动离心管，边逐滴加入 1 mL 预热的1% FBS培养基 (5-10秒内)，然后静置。

边晃动离心管，边缓慢加入 2 mL 预热的1% FBS培养基 (10-15秒内)，然后静置。

边晃动离心管，边缓慢加入 4 mL 预热的1% FBS培养基 (约20秒内)，然后静置。

边晃动离心管，边缓慢加入 8 mL 预热的1% FBS培养基 (30-40秒内)。

3. 离心与洗涤 (Centrifugation & Washing)

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⚠️ 关键优化点：温和离心

原代细胞非常脆弱，过高的离心力是导致复苏失败的主要原因。请务必使用离心机上的RCF(g)设置，并严格控制相对离心力在300-400 x g之间。

洗涤步骤

第一次离心: 在 300-400 x g 条件下，室温离心 8-10 分钟。

小心吸去上清，用 1 mL 预热的完全培养基 (含10% FBS) 轻轻重悬细胞。

加入 9 mL 完全培养基，将细胞悬液补足至10 mL。

第二次离心: 再次在 300-400 x g 条件下，室温离心 5-8 分钟，以彻底清除DMSO。

4. 细胞计数与培养 (Counting & Plating)

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小心吸去上清，用适量 (如1-2 mL) 的完全培养基重悬细胞。

取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝等体积混合，进行细胞计数并计算存活率。

根据实验需求，将所需数量的细胞接种至培养器皿中。

将细胞置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

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